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Avenir de l'emploi du système CRISPR-Cas9 en génétique.
Jean-Paul Baquiast 12/03/2016

Introduction

Le système CRISPR-Cas9 (pour Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) soit Courtes répétitions en palindrome regroupées et régulièrement espacées, est depuis les années 2010 devenu un outil de génie génétique présenté comme révolutionnaire et permettant de modifier plus facilement et plus précisément les séquences d’ADN. Ceci par suppression et insertion de gènes. Cependant si l'outil peut à terme permettre d'éliminer certaines maladies, notamment génétiques, des inquiétudes se sont faites jour quant à son utilisation en génétique humaine. La technique peut en effet également s'appliquer sur des cellules héréditaires, susceptibles de modifier ainsi les descendances.

Sur la découverte

Dérivée d'un mécanisme de défense bactérien, CRISPR-Cas9 se répand dans les laboratoires. Son objectif est de traiter de nombreuses maladies génétiques, par modification de gènes défectueux à l'origine de diverses maladies. Un grand enthousiasme s'est développé à l'annonce de ces perspectives. Le jury du prix Breakthrough a récompensé en novembre 2014 deux scientifiques qui avaient été les auteures de la découverte., dont la française Emmanuelle Charpentier (image ci contre)

La technique CRISPR-Cas9 permet de modifier le génome de divers types de cellules, tant chez les bactéries que chez les plantes ou chez les animaux, ceci avec une grande facilité. En 2014, elle a franchi deux nouvelles étapes importantes. D'abord, elle s'est révélée utilisable sur des primates. Ensuite, elle a permis de corriger des maladies génétiques in vivo sur des souris.

CRISPR-Cas9 tire son origine d'études fondamentales du génome bactérien. En 1987, Atsuo Nakata et son équipe de l'université d'Osaka, au Japon, découvrent des séquences d'ADN répétitives dans le génome de bactéries Escherichia coli. Dans certaines parties de ces séquences, les quatre « lettres » constitutives de l'ADN forment des suites identiques dans un sens de lecture ou dans l'autre, comme des palindromes.

La découverte n' a guère suscité d'intérêts avant 2005, quand des bio-informaticiens découvrent que les morceaux d'ADN intercalés entre ces palindromes sont souvent des séquences d'ADN de virus. En 2007, l'industrie fromagère danoise a constaté que lorsque les bactéries servant à fabriquer des yaourts et des fromages ont des séquences CRISPR, elles survivent mieux aux infections virales. Il s'agit d'une sorte de système immunitaire capable de garder la mémoire d'une agression par un virus ou une séquence d'ADN étrangère, afin de combattre ce même agresseur lorsqu'il envahit à nouveau la bactérie

Comme pour n'importe quel gène, chaque séquence CRISPR, qui contient donc de l'ADN viral, est transcrite en plus petites molécules intermédiaires, des ARN, qui contiennent la séquence complémentaire de l'ADN viral. Mais plutôt que d'être ensuite traduits en protéines, ces ARN vont se lier à une enzyme découpeuse d'ADN nommée Cas9. Si cette structure rencontre l'ADN correspondant d'un virus dans la cellule, l'ARN s'y apparie et la Cas9 le coupe en deux. Le système permet de détecter facilement une séquence d'ADN donnée, puis la découper avec précision.

Perspectives

Il en découle que la Cas9 permettrait de supprimer un gène et ainsi découvrir sa fonction, ou l'éliminer s'il est néfaste ou déficient. Il suffirait de fabriquer en laboratoire un correspondant au gène que l'on souhaite cibler, puis de l'associer à une enzyme Cas9. Cette dernière découperait alors le gène. Le CRISPR-Cas9 possède plusieurs avantages par rapport aux meilleures enzymes découpeuses d'ADN (les nucléases) développées avant lui. Il s'agit de la simplicité. Avec CRISPR-Cas9, il suffit de fabriquer de petits ARN, une technique déjà utilisée dans les laboratoires pour faire synthétiser telle ou telle protéine dans une cellule, ou pour perturber le fonctionnement de gènes. En utilisant plusieurs ARN guides, diverses équipes ont très facilement réussi à cibler plusieurs gènes à la fois, y compris dans des cellules humaines.

Un second avantage est la rapidité, liée à la simplicité du système. Enfin CRISPR-Cas9 est bien moins coûteux que ses concurrents, l'obtention d'ARN sur mesure faisant appel à des techniques de routine en biologie moléculaire. Il en résulte que de très nombreues expériences et publication à ce sujet sont désormais produites. Les chercheurs français y ont leur part.

En 2014, comme indiqué ci-dessus, l'outil a franchi deux caps importants :un premier succès sur des primates, et sa capacité à corriger des maladies génétiques sur des souris. En mars 2016 une équipe de l'Institut de technologie du Massachussets a concrétisé le potentiel médical de CRISPR-Cas9. Les chercheurs l'ont utilisé sur la souris pour corriger une maladie génétique incurable du foie. Le gène injecté chez des cellules malades a permis à certaines d'entre elles de redevenir saines et de proliférer. En août 2016, c'est une autre maladie génétique incurable la myopathie de Duchenne, qui a chez la souris cédé devant l'emploi de CRISPR-Cas9, au niveau de l'embryon.

Pour utiliser CRISPR-Cas9 sur l'homme , il faudra s'assurer qu'il n'induit pas de lésions dans d'autres régions du génome. Il faudra aussi augmenter la fréquence à laquelle les cellules ciblées sont corrigées. Tout ceci soulève déjà des inquiétudes. Différents moralistes font valoir qu'il s'agira de modifications de grande ampleur du génome humain, pour la réalisation éventuelle de surhommes. L'objectif sera lointain, mais tout laisse à penser qu'il sera poursuivi.

Amélioration de la technique

L'étude citée ci-dessous décrit une technique permettant d'améliorer l'efficacité de l'effet knock out du CRISPR-Cas9 dans les processus permettant d'éliminer certains gènes et de les remplacer par d'autres

Légende Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) technology employs a guide RNA to direct the Cas9 enzyme (light blue) to a target DNA sequence. Once there, Cas9 will bind when it finds a protospacer-adjacent motif sequence (red) in the DNA and cut both strands, priming the gene sequence for editing. (credit: Adapted from OriGene Technologies)

Résumé de  Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency
Background: Single-guide RNA (sgRNA) is one of the two key components of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 genome-editing system. The current commonly used sgRNA structure has a shortened duplex compared with the native bacterial CRISPR RNA (crRNA)–transactivating crRNA (tracrRNA) duplex and contains a continuous sequence of thymines, which is the pause signal for RNA polymerase III and thus could potentially reduce transcription efficiency.
Results: Here, we systematically investigate the effect of these two elements on knockout efficiency and showed that modifying the sgRNA structure by extending the duplex length and mutating the fourth thymine of the continuous sequence of thymines to cytosine or guanine significantly, and sometimes dramatically, improves knockout efficiency in cells. In addition, the optimized sgRNA structure also significantly increases the efficiency of more challenging genome-editing procedures, such as gene deletion, which is important for inducing a loss of function in non-coding genes.
Conclusions: By a systematic investigation of sgRNA structure we find that extending the duplex by approximately 5 bp combined with mutating the continuous sequence of thymines at position 4 to cytosine or guanine significantly increases gene knockout efficiency in CRISPR-Cas9-based genome editing experiments.

Référence
Ying Dang, Gengxiang Jia, Jennie Choi, Hongming Ma, Edgar Anaya, Chunting Ye, Premlata Shankar and Haoquan Wu. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency.
Genome Biology201516:280 DOI: 10.1186/s13059-015-0846-3 (open access)

Pour en savoir plus

Voir Wikipedia